切向流過濾技術(shù)：重組蛋白制備的得力助手
時(shí)間：2024.06.17
蛋白質(zhì)是生物大分子，具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和多種功能。蛋白質(zhì)作為生物學(xué)“中心法則”的終產(chǎn)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。深入了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)是解鎖“生命密碼”和揭示所有特定生物學(xué)過程機(jī)制的關(guān)鍵。雖然從天然來源中提取的蛋白質(zhì)為其特征研究提供了關(guān)鍵的起始物料，但由于樣品差異，蛋白質(zhì)數(shù)量匱乏和質(zhì)量不一，給蛋白質(zhì)生物化學(xué)領(lǐng)域帶來了挑戰(zhàn)。
因此，重組蛋白表達(dá)的概念應(yīng)運(yùn)而生，該過程通過載體將編碼靶蛋白（POI）的外源基因引入宿主細(xì)胞，并通過劫持宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)制造機(jī)制產(chǎn)生POI的過程。
四十多年前，質(zhì)粒（通常以環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式出現(xiàn)）被確定為細(xì)菌中外源基因的主要信使，從而開啟了基因工程的新紀(jì)元，使重組蛋白表達(dá)成為可能。在過去四十年里，研究人員已開發(fā)了各種載體系統(tǒng)以及宿主細(xì)胞，包括原核生物（大腸桿菌）和真核生物（例如酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞），以產(chǎn)生接近其自然狀態(tài)的廣譜重組蛋白，促進(jìn)生化研究、工業(yè)催化、食品加工、疫苗和治療等方面的發(fā)展。
因此，重組蛋白表達(dá)的概念應(yīng)運(yùn)而生，該過程通過載體將編碼靶蛋白（POI）的外源基因引入宿主細(xì)胞，并通過劫持宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)制造機(jī)制產(chǎn)生POI的過程。
四十多年前，質(zhì)粒（通常以環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式出現(xiàn)）被確定為細(xì)菌中外源基因的主要信使，從而開啟了基因工程的新紀(jì)元，使重組蛋白表達(dá)成為可能。在過去四十年里，研究人員已開發(fā)了各種載體系統(tǒng)以及宿主細(xì)胞，包括原核生物（大腸桿菌）和真核生物（例如酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞），以產(chǎn)生接近其自然狀態(tài)的廣譜重組蛋白，促進(jìn)生化研究、工業(yè)催化、食品加工、疫苗和治療等方面的發(fā)展。
高質(zhì)量的重組蛋白是研究和藥物開發(fā)的重要起始材料。重組蛋白質(zhì)量的關(guān)鍵屬性包括純度、寡聚狀態(tài)、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性、折疊、翻譯后修飾（PTM）、活性……由于蛋白質(zhì)本身的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化往往具有挑戰(zhàn)性。
在對(duì)目的蛋白表達(dá)純化時(shí)，需要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游對(duì)下游的影響。同時(shí)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、壁膜空間和細(xì)胞外）。
重組蛋白下游工藝涉及到的膜過濾操作單元有：澄清過濾、切向流過濾、除病毒過濾及除菌過濾等步驟，不同階段的過濾工藝的開發(fā)都需要嚴(yán)格把控。
在對(duì)目的蛋白表達(dá)純化時(shí)，需要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游對(duì)下游的影響。同時(shí)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、壁膜空間和細(xì)胞外）。
重組蛋白下游工藝涉及到的膜過濾操作單元有：澄清過濾、切向流過濾、除病毒過濾及除菌過濾等步驟，不同階段的過濾工藝的開發(fā)都需要嚴(yán)格把控。
相比于傳統(tǒng)的高速離心機(jī)結(jié)合深層過濾等分離技術(shù)，切向流技術(shù)則具有高效率、低能耗、無添加化學(xué)成分，操作條件緩和等一系列優(yōu)勢。
切向流過濾根據(jù)孔徑可以分成微濾和超濾，一般微濾（MF）常用于較為精細(xì)的固液分離，如重組蛋白的層析前去除細(xì)胞/細(xì)胞碎片，酵母發(fā)酵液，動(dòng)植物粗提液，大腸桿菌裂解液等，省去傳統(tǒng)的離心和預(yù)過濾等步驟。
而超濾（UF）使用范圍更寬，膜孔徑較小，主要用于重組蛋白的脫鹽、脫醇和濃縮、內(nèi)毒素和核酸去除。膜孔徑的選擇極其重要，超濾膜 1～1000kDa MWCO，微濾膜0.1～0.65um。選擇膜孔徑均一度高的濾膜，可以保證截留收率同時(shí)獲得更快地透過速度，有利于雜質(zhì)的透過去除，改善實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
切向流過濾根據(jù)孔徑可以分成微濾和超濾，一般微濾（MF）常用于較為精細(xì)的固液分離，如重組蛋白的層析前去除細(xì)胞/細(xì)胞碎片，酵母發(fā)酵液，動(dòng)植物粗提液，大腸桿菌裂解液等，省去傳統(tǒng)的離心和預(yù)過濾等步驟。
而超濾（UF）使用范圍更寬，膜孔徑較小，主要用于重組蛋白的脫鹽、脫醇和濃縮、內(nèi)毒素和核酸去除。膜孔徑的選擇極其重要，超濾膜 1～1000kDa MWCO，微濾膜0.1～0.65um。選擇膜孔徑均一度高的濾膜，可以保證截留收率同時(shí)獲得更快地透過速度，有利于雜質(zhì)的透過去除，改善實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
在重組蛋白的制備過程中，切向流技術(shù)主要用于以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：
1. 濃縮
重組蛋白在宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往以較低濃度存在。切向流技術(shù)可以通過選擇適當(dāng)?shù)哪た讖?，保留目?biāo)蛋白，而讓小分子如鹽分、水和代謝廢物通過，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的濃縮。
2. 純化
切向流技術(shù)能夠有效去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，提高重組蛋白的純度。這一步驟對(duì)于減少潛在的免疫原性反應(yīng)和提高藥物的安全性至關(guān)重要。
3. 緩沖液置換
在重組蛋白的進(jìn)一步加工或儲(chǔ)存前，可能需要將其從一種緩沖液轉(zhuǎn)移到另一種更適合的緩沖液中。切向流技術(shù)可以在不損失蛋白活性的前提下，實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)換。
切向流技術(shù)雖然廣泛地應(yīng)用于重組蛋白的濃縮、分離純化，但也有一定的局限性，如果要分離的兩種產(chǎn)品的分子量相差不到5倍，則無法用切向流進(jìn)行分離。
在重組蛋白質(zhì)分離純化中，切向流技術(shù)是一項(xiàng)應(yīng)用較廣泛的蛋白純化技術(shù)，選擇合適的膜材質(zhì)、孔徑、流道網(wǎng)、TMP、工藝流速、剪切力等條件至關(guān)重要。單一片面的選擇在蛋白質(zhì)的分離和純化中效果甚微，要結(jié)合蛋白特性、緩沖體系來開展蛋白質(zhì)的分離，才能將開發(fā)的膜過濾工藝成功的放大，獲得蛋白較好的分離效果。
1. 濃縮
重組蛋白在宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往以較低濃度存在。切向流技術(shù)可以通過選擇適當(dāng)?shù)哪た讖?，保留目?biāo)蛋白，而讓小分子如鹽分、水和代謝廢物通過，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的濃縮。
2. 純化
切向流技術(shù)能夠有效去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，提高重組蛋白的純度。這一步驟對(duì)于減少潛在的免疫原性反應(yīng)和提高藥物的安全性至關(guān)重要。
3. 緩沖液置換
在重組蛋白的進(jìn)一步加工或儲(chǔ)存前，可能需要將其從一種緩沖液轉(zhuǎn)移到另一種更適合的緩沖液中。切向流技術(shù)可以在不損失蛋白活性的前提下，實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)換。
切向流技術(shù)雖然廣泛地應(yīng)用于重組蛋白的濃縮、分離純化，但也有一定的局限性，如果要分離的兩種產(chǎn)品的分子量相差不到5倍，則無法用切向流進(jìn)行分離。
在重組蛋白質(zhì)分離純化中，切向流技術(shù)是一項(xiàng)應(yīng)用較廣泛的蛋白純化技術(shù)，選擇合適的膜材質(zhì)、孔徑、流道網(wǎng)、TMP、工藝流速、剪切力等條件至關(guān)重要。單一片面的選擇在蛋白質(zhì)的分離和純化中效果甚微，要結(jié)合蛋白特性、緩沖體系來開展蛋白質(zhì)的分離，才能將開發(fā)的膜過濾工藝成功的放大，獲得蛋白較好的分離效果。
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